Metode inokulacije biljaka

Prije nego što nastavite s inokulacijom biljaka, treba ih pripremiti. Oni bi trebali biti bez infekcija, očito zdravi. Za to su pokusne biljke najbolje uzgajati iz zdravih sjemenki u stakleniku ili uzgojnoj kući u cvjetnim posudama (cvjetnim posudama) ispunjenim tlom bez infekcije. Sjeme prije sjetve dezinficira se uobičajenim sredstvima za obradu, a tlo se autoklavira pod pritiskom 1-2 atm.

Prilikom rasta biljke se zalijevaju bez vlaženja površine lišća i stabljika (voda se izlije izravno na tlo ili kroz posebno umetnute cijevi). Ako je moguće, isključite vanjsku ili slučajnu infekciju koju prenose insekti ili iz zraka.

Ako se eksperimentalno bilje u stakleničkom pokusu ne može dobiti iz sjemena, tada se biljke koje rastu u divljini uzimaju i presađuju u saksije, nakon čega se čuvaju u stakleniku najmanje jedno (po mogućnosti 1,5-2,0) razdoblje inkubacije bolesti uzrokovana ispitivanom gljivicom. Praktično za to je 7-10 dana sasvim dovoljno.

Kod inokulacije biljaka gljivama u polju potrebno je prethodno izolirati označene nadzemne organe iz okoliša ostakljenim drvenim okvirom, papirnim kapama, plastičnim vrećicama, staklom šarke ili čašama svjetiljke - potonji su vezani ulogom, a gornja i donja rupa zatvorene su pamučnim tamponom , Takva preliminarna izolacija u razdoblju od 1-2 razdoblja inkubacije potrebna je kako bi se provjerilo stvarno zdravo stanje eksperimentalnih biljnih organa. Štoviše, u svim slučajevima nastoje osigurati da se izolirane biljke ili njihovi organi normalno razvijaju, da nisu etiolirani, klorotični, propadaju itd..

Moguće je provesti eksperimente na izrezanim dijelovima biljaka umočenim u vodu, u hranjivoj otopini, kao i na odvojenim listovima smještenim u otopini benzimidazola..

Načini inokulacije biljaka prilično su raznoliki i ovise o biologiji gljive i ulozi infekcije u patogenezi bolesti, kao i o ciljevima ispitivanja (provjera patogenosti sojeva, procjena otpornosti sorti i sl.). Razmotrimo nekoliko tehnika cijepljenja koje su prilično dobro testirane i mogu se preporučiti u praktičnom radu..

Inokuliranje biljaka može se provesti i patogenom koja se uzgaja na umjetnom hranjivom mediju, kao i prirodnom populacijom gljivičnih sporova. Ovisno o zadatku, koriste se razni inokuli - micelij, spore prikupljene od jedne sorte biljke domaćina ili predstavljaju zemljopisnu populaciju itd..

Prilikom odabira metode inokulacije uzima se u obzir produktivnost rada jer se često ocjenjuju tisuće sorti. Metode i vrijeme umjetne infekcije što bliže prirodnoj. U svim slučajevima se stvaraju uvjeti koji su optimalni za rast patogena (temperatura, vlaga). Broj inokuliranih biljaka trebao bi biti najmanje 10 uz obaveznu kontrolu.

Brojne bolesti (prašnjava smreka pšenice i ječma, ergot raži, helmintosporioza ječma i zobi, žuta hrđa pšenice itd.) Karakteriziraju prodiranje infekcije kroz cvijeće i jajnike. U tom se slučaju inokulacija provodi primjenom suhih spora ili suspenzije gljivičnih spora na cvijeće i jajnike. Na primjer, M. K. Khokhryakov (1969) ukazuje da je najjednostavnija metoda inokulacije pšenice i ječma smradom prašine prskanje klamidospora uzročnicima bolesti za vrijeme cvjetanja žitarica iz vreća s gazom ili rezanje pogođenih ušiju.

V. I. Krivčenko (1963.) modificirao je vakuumsku metodu inokulacije pšenice smutnim patogenom koristeći poseban uređaj koji se sastoji od cilindra u koji su smještene uši preostale na vinovoj lozi. Ovaj cilindar ima dvije izlazne cijevi, od kojih je jedna spojena na pumpe, a druga služi za dovod zraka. Odozdo se kroz poseban vakuumski stezni čep i crijevo dovodi suspenzija spora (0,2 g spora na 0,5 l vode). Suština metode je da, dok izbacivanje iz cilindra iz ušiju zraka, voda s sporama ulazi tamo. Nakon dovoda zraka, suspenzija se vraća u posudu. Za dobivanje pouzdanih podataka dovoljno je zaraziti 6-10 ušiju jedne sorte, a prilikom ocjenjivanja obitelji i linija hibrida najmanje tri uši.

E. E. Geshele (1964.) dijeli metode inokulacije smrvičastog smrca u dvije skupine: pojedinačnu infekciju cvjetova i cijelog uha. U prvom slučaju jedan gornji i dva donja šiljka režu se škarama, a srednji cvjetovi uklanjaju se pincetama od ostatka. Nakon toga se svaki cvijet otvara i spore se uvode pincetom. Ova metoda ima niz modifikacija. Konkretno, možete zaraziti cvijet posebnom pipetom s kruškom. U drugom slučaju, materijal koji sadrži infektivni zastoj se nanosi na zdravo uho, nakon što je prethodno izvršio urezi na razini zuba šiljka..

Cvjetovi ječma inokuliraju se konidijom uzročnika prugaste helmintosporijaze pomoću vakuum uređaja u razdoblju kada šiljak još nije napustio cijev, samo vrhovi osica.

Cvjetovi voćnih kultura zaraženi su gljivicama roda Monilinia, primjenom suhih konidija navlaženim krajem iglice na stigme štetnika. Zatim se cvjetovi prskaju vodom iz boce s raspršivačem i na njih se stavlja izolator od gaze natopljen vodom, koji je dan prekriven plastičnim filmom. U južnim krajevima, osim toga, cijepljene cvasti cvatu i tamne - rade to isto kada se zaraze ušima.

Inokulirane voćne grane izolirane su na isti način kao i cvijeće. Ako se provode eksperimenti na posječenim izdancima, nakon nanošenja infekcije na lišće, izdanci se postavljaju u vlažne komore od staklenih čepova obloženih vlažnim filtrirnim papirom iznutra 24 sata pri optimalnoj temperaturi.

Kada se infektivni agensi primjenjuju na lišće, stabljike i druge organe biljaka, u pravilu se koristi suspenzija spore patogena (konidija). Voštani premaz na površini listova otežava prodiranje gljivica, pa se uklanja prije inokulacije puštajući list da prođe između vlažnih prstiju. Materijal koji sadrži infekciju u pravilu se nanosi na donju stranu lista u obliku kapljice vodene suspenzije iz spreja ili trljati inokulum listom skalpelom. Ponekad se koriste suhe spore koje se navlaženim lišćem nanose sterilnom četkom..

Za umjetnu infekciju lišća izravno na biljkama mogu se koristiti vlažne komore malog volumena u obliku celofanskih čašica (promjera 20 mm) pritisnutih uz rubove elastičnom oprugom (metoda M. S. Dunina).

Inokulirane biljke određeno vrijeme (12, 24, 48 sati) stavljaju se u vlažnu komoru kako bi se osigurala potpunija infekcija. Na terenu se to postiže primjenom suspenzije spora u oblačnim danima ili navečer, posebno ako se očekuje rosa.

Zarazni materijal hrđe od žitarica obično se priprema dva sata prije primjene na biljke. Da biste to učinili, uzmite 200-300 zahvaćenih lišća, uronite ih u vodu (0,5-1 l) i isperite uredospore s njih. Na sjetvu od 150-200 m2 troši se oko 150 litara suspenzije (L. F. Rusakov, 1926). U stacionarnim uvjetima inokula se priprema unaprijed u stakleniku ili na posebnim usjevima. Za infekciju parcela - distributera hrđe, treba uzeti 5 mg uredospora po 1 m2, prskajući ih zajedno s talkom u omjeru 1:30 ili 1: 100. Kontinuiranom inokulacijom na 1 m2 troši se 2 mg održivih uredospora u slučaju naknadnog oblaganja biljaka filmom i 20 mg bez vlažne komore (K. M. Stepanov, 1966.).

Umjetna infekcija biljaka baziosporima rđe (na primjer, linearna ili smeđa) provodi se u vlažnoj komori. Dijelovi biljaka s razvijenim teletosporama uzimaju se i postavljaju iznad inokulirane biljke na način da, kako sazrijevaju, bazidiospore padaju na njegovu površinu.

Postoje izvješća o mogućnosti inokuliranja patogena pirikularije i praškaste plijesni s pojedinačnim lišćem žitarica smještenih u vlažne komore, kao i malim krugovima živih listova (promjera 12-14 mm) duhana s gljivom. Peronospora tabacini. Istodobno se stavljaju u Petrijeve posude, čije je dno obloženo s tri sloja filtriranog papira zasićenog bez viška hranjivom otopinom sljedećeg sastava (u g na 100 ml vode): kalij i natrijev tartarat (KOSO - CHON - CHON - COONa) - 0,5- K2NRO4 - 0,1 - KNO3 - 2,0 - Co (N03) 2 - 0,06 - KCl - 0,03 - MnO4 - 0,001 i Mg04 - 0,5 (Isard, 1960.).

Kada se, primjerice, proučavaju obligati parazita drvenih vrsta, koriste se posebne metode. Kada radite s vokalumetickim gljivicama koje uzrokuju deformaciju plodova i grana, izdanci s znakovima oštecenja odrezani od bolesnih stabala postavljaju se u posude s vodom kako bi se zatvorili askospore, a koje su prekrivene širokom staklenom kapom. Ispod ruba haube postavljaju se brtve visine oko 10 cm za pristup zraku. Nakon 1-2 dana na zahvaćenim organima pojavljuje se marsupijalna sporulacija gljivica. Nastali askospore prenose se sterilnim skalpelom eksperimentalnim zdravim biljkama, na jajnike ili pruge koje se počinju razvijati. Istodobno se vaga primjenjuje prisilno. Koriste se i druge posebne tehnike koje se temelje na biologiji patogena, ciljevima eksperimenta i mogućnosti infekcije koja prodire u određenim uvjetima (Geshele, 1971).

Pri radu s uzročnikom graška askohitoza, prema metodologiji Državne komisije za ispitivanje sorte, inokulum se dobiva u epruvetama na obodnom agaru. Iz jedne epruvete gljivične kulture priprema se suspenzija tako da se protrese u 1 litri vode. Štoviše, u prosjeku bi trebalo sadržavati 40-50 konidija patogena u jednoj kapljici tekućine. Potroši se 2 l suspenzije na 1 m2 sjetve.

Sjeme se može cijepiti suho ili mokro. Zagađenje sjemena primjenjuje se pri proučavanju tvrdog pšenice. Istodobno se potroši 1 kg sjemena na 1 kg spora, ovisno o očekivanim vremenskim uvjetima tijekom sjetve i u narednim danima. Kada vrijeme nije povoljno za izlijevanje smređa, opterećenje zaraze se povećava. Optimalnim uvjetima smatra se temperatura tla na dubini sjemena 6 -10 ° C. Ako se trebaju ispitati male semenke, tada se one oprašuju prekomjernom količinom spora i prolaze kroz sito. Da bi se stvorilo potrebno zarazno opterećenje, sjeme ječma i zobi treba ukloniti iz filmova, a E. E. Geshele (1964) preporučuje uklanjanje samo onog dijela filma koji pokriva zametak. U ostalim slučajevima sjeme se raspršuje tankim slojem na gustoj površini, prska se suspenzijom spora, drži se u vlažnoj komori. Sjemenke ječma i zobi također se cijepe smrtonom uronjenjem u suspenziju spora. Za 100 g sjemenki priprema se 100 cm3 suspenzije od 4-10 g spora. Sjeme se drži u suspenziji 15 minuta, temeljito miješajući smjesu tri puta. Potom se sjeme stavi u vreće s gazom, ostavi da se ocijedi vodom i inkubira 24 sata na 20 ° C. Nakon sušenja sjeme se sije.

Sjemenke zobi, onečišćene buntima, s uklonjenim filmovima klijaju u kutije s vlagom od 25 tla i temperaturom od 20 ° S. Nakon pojave presaduju se u polje. Ista metoda E. E. Geshele (1964.) preporučuje primjenu u slučaju umjetne infekcije ječma smutom i patogenom prugaste helmintosporioze.

Pri inokuliranju (shtambov) voćaka na koru nakon 1-1,5 cm primjenjuju se dva poprečna rezova, između kojih se kora sije u sredini u uzdužnom smjeru, savijajući krila, čineći nekoliko plitkih posjekotina drva i uvodeći kulturu ispitivanog patogena zajedno s komadom agarskog medija. Zatim se kortikalni preklopi zatvaraju, a mjesto infekcije prekriva se plastičnim omotačem ili pergamentom, pričvršćujući rubove vrpcom ili kanalnom trakom. Kada koristite papir, pod preljev se stavlja navlaženi komad pamučne vune..

U slučaju infekcije koštanih grana patogenima koji se mogu razviti samo u prethodno oslabljenim tkivima, potonji se katerteriziraju u blizini mjesta inokulacije.

U slučaju umjetne infekcije vrsta drveća parazitima (gljivama roda) Cytospora i dr.) eksperimenti se najbolje izvode u laboratorijskim uvjetima na odsječenim izdancima. Za to su iz testne sorte izrezani lignificirani izbojci dugi 150 mm i debljine oko 10 mm u količini od 20 kom. (10 komada za iskustvo i kontrolu). Zatim se na udaljenosti od 50 mm od vrha izdanaka vrši rez do dubine od 5 mm - nakon površinske sterilizacije u njega se stavlja agarni medij s gljivičnim micelijem. Mjesto inokulacije zategnuto je plastičnim omotačem, koji je na rubovima fiksiran nitima ili izolacijskom trakom. Na poleđini izbočine ispod filma se stavlja pamuk, koji se po potrebi povremeno navlaži injekcijom šprice kroz film.

Reznice se stavljaju u čaše s vodom ili s prethodno kalciniranim vlažnim pijeskom. Budući da su u vodi ili pijesku, reznice počinju nedostajati minerale u tlu, njihove vitalne funkcije slabe i umiru. Ovaj postupak traje dugo, što vam omogućuje utvrđivanje vremena bolesti reznica različitog stupnja slabljenja, dakle, patogene sposobnosti gljivica i otpornosti biljaka.

Zaraženi izdanci uspoređuju se s kontrolom pomoću ordinalnog kriterija X, obično u vrijeme smrti 2/3 reznica najosjetljivijih sorti. U slučaju kada će pojačano stvaranje kalusa proći uz rubove rane, rana se čisti i vrši se sekundarna inokulacija bez prekida eksperimenta.

Sadnice sa stabala mogu se inokulirati unošenjem infekcije u stabljiku medicinskom špricom. Možete zaraziti početak korijena izravno u tlu, oštetivši ih metalnom šipkom (spore patogena se uvode u rezultirajuću ranu).

Inokulacija plodova i korijenskih usjeva provodi se primjenom suspenzije spora patogena na njihovu sterilnu površinu. U ovom slučaju možete koristiti i suhe spore, probušiti ili urezati kožu ploda, ili ubrizgati vodenu suspenziju spora (1 kap) špricom ispod kože. Ponekad se infekcija uvodi u duboki rez korijena, a zatim ubaceni dio na prvobitno mjesto.

Najčešće se inokulum primjenjuje na tlo kako bi se stvorila zarazna pozadina bez oštećenja korijenskih sustava - gljiva se najprije razmnožava na posebnim podlogama.

Za dugogodišnji rad sa širokim rasponom biljnih vrsta i sorti koriste se razne zarazne pozadine. Mogu biti prirodne i umjetne, a mogu se razlikovati i u stupnju očitovanja bolesti (slabe, jake).

Na primjer, u tlu stvarajući zaraznu pozadinu, uzročnici pamučne vune, čiste kulture gljiva prvo se uzgajaju u tikvicama sa sterilnim sjemenkama zobi (100 zrna na 100 cm3 vode). Tada se kulture razmnožavaju u bocama sa sredinom istog sastava. Na svakih 100 m2 površine primjenjuje se 3-4 kg kulture (druga metoda opisana je u nastavku).

Unošenje gljivičnih kultura u tlo koristi se i pri radu s patogenima vena (jaja) patlidžana i papra - sklerotija patogena koristi se tijekom pupoljavanja biljaka uz prethodno oštećenje korijena.

Izvodi se inokulacija sadnica ječma i pšenice uzročnicima helmintosporioze, fusarija, opioboleza i drugih patogena, uz uvođenje kulture gljiva u sjemenske redove zajedno sa sjemenkama. Koriste se čiste kulture gljiva koje se uzgajaju na žitaricama ili agarskom mediju (0,5 škrob, 0,02 KH2P04, 0,02 Ca (N03) 2 0,02 peptona i 2 agar agar). Također se koristi i zaraženi dio slame. Redovi tijekom sjetve prekriveni su zaraženom slamom u količini od 20 zdrobljenih biljaka pomiješanih s 1 kg humusa na 25 m sjetvene vrste (E. E. Geshele, 1964).

Pri stvaranju zarazne pozadine patogena snježnog plijesni smjesa sojeva (Fusarium NIVale, Typhula incarnata itd.), koje se prethodno uzgajaju na zakiseljenom agaru krumpira i zatim razmnožavaju na sterilnom zobi. Prije uvođenja kulture gljiva u tlo, oni se pomiješaju sa zemljom u jednakim količinama i ravnomjerno raspoređuju po površini parcele. Infekcija se unosi u tlo u jesen brzinom 200 g kulture zob na 1 m2. Zagađeno tlo je odozgo prekriveno slojem zemlje veličine 1-1,5 cm, a prve godine na zaraznoj pozadini obavlja se izviđačka sjetva. Ako je istodobno izlučivanje biljke iz patogena jednolično, onda se sljedeće godine parcela koristi za eksperimente (V. K. Neofitova, N. A. Novik, 1969).

Laneno laneno hrđe zarazno pozadina (Melampsora lini) stvoriti uz pomoć slame linča, pogođene uzročnikom bolesti (mješavina sorti). Takva slama (stabljika) polaže se u jesen pod snijeg. U proljeće se zahvaćene stabljike drže u vodi 2-3 sata i provjerava se klijanje teletospora, klijajući ih na 50-100 segmenata stabljika u vlažnoj komori. Proklijale spore broje se 48 sati nakon što se stave u vlažnu komoru.

Prva metoda primjenjiva je u proučavanju biologije patogena i inokulacije pojedinih biljaka, druga - u terenskoj procjeni sorti.

Prilikom stvaranja zarazne (provokativne) pozadine za uzročnika vertikalinskog vitka pamuka na parceli u prvoj godini, biljne krhotine pogođene gljivicom (guza-pai) mirišu i obilno zalijevaju tlo. Sljedeće godine obavlja se izravnavajuća sjetva kultivara pamuka osjetljivog na ovu bolest, nakon berbe pogođeni biljni ostaci ponovo mirišu. Sjetva za izjednačavanje također je potrebna kako bi se provjerila pouzdanost provokativne pozadine. Tek nakon takve provjere može se smatrati pripremljenom za ispitivanje sorti.

Infekcija lana antracnozom (Colletotrichum lini) provodi unošenjem infekcije u tlo i prskanjem sadnica suspenzijom spora. Kao zarazni materijal koriste se pogođena lanena slama i sadnice, kao i čista kultura patogena koja se uzgaja na ovsu i agaru. Da bi se zarazio tlo, u podlogu se ugrađuje čista kultura gljiva, bolesne sadnice i lanena slama. Vegetacijske biljke inokuliraju se suspenzijom spora u fazi sadnje (T. V. Krylova, Yu. T. Karpunina, 1969).

Kada se zarazi bijelom truležom suncokreta (Sclerotinia libertiana) primijeniti metodu kojom se istovremeno sa sjemenkama pomoću ručne sadnje u svako gnijezdo uvode 2-3 mala sklerotija uzročnika bolesti patogena. Navedena metoda omogućuje vam da na bazalnom dijelu stabljike dobijete znakove bolesti (A. I. Lukashevich, 1969.).

Povećanje zaliha suncokreta u prašnoj plijesni (Plasmopara helianthi) provode se na sljedeći način. Prvo se priprema suspenzija zoospora, za koju su zahvaćeni listovi i sloj vlažnog filtrirnog papira postavljeni u mokre komore. Vlažne komore se čuvaju na temperaturi od 16-20 ° C. Zrele konidije uklanjaju se s površine listova britvicom ili mokrim tamponom i priprema se suspenzija. Inokulacija biljaka vrši se držanjem suspenzije ljepljivih sjemenki u suspenziji 5-8 sati na temperaturi od 17-19 ° C. Zatim se sadnice suncokreta sadi u kutije veličine 50 × 40 × 15 cm, staklenicima ili otvorenom tlu. U kutije i na gredicama biljke se postavljaju prema shemi: između redova 10-15, u red 2-3 cm - u otvoreno tlo - između redova 45-60 i u red 3-5 cm.

Uzročnik sklerotične djeteline uzgaja se iz sklerotije na kriške krumpira u vlažnoj komori. Zatim se pod biljkama na korijenovom vratu stave kriške s razvijenim micelijem parazita.

Na slične načine povećava se broj infekcija u tlu višekratnim unošenjem biljnih ostataka zaraženih uzročnicima plijesni suncokreta, korijena i korijena truleži pšenice i ječma, kobilice, kupusa, askohitoze graška itd..

Patogeni u tlu (gljivice rođenja djeteta) Verticillium, Fusarium itd.) usjevi voća i bobičastog voća unaprijed se razmnožavaju u čistim kulturama na hranjivom mediju. Obično se kao hranjivi supstrat koriste žitarice žitarica, koje se u tikvicama (otprilike u omjeru 1: 1) prelije vodom i sterilizira u autoklavu pod pritiskom od 1 atm. Zatim se infekcija odgovarajuće gljivice unese u tikvice sa zrnom i inkubira 10-15 dana uz povremeno miješanje da se supstrat pomiješa. Istodobno, sjeme golih žitarica (pšenica, raž, mahunarke) pomiješa se s pljeskom ili sitno sjeckanom slamom kako bi se izbjeglo stvaranje mesnate mase..

Stope primjene takve kulture gljiva u tlu variraju ovisno o vrsti patogena i biljnoj sorti. Kao potporu možete uzeti da se 3 kg kulture nanosi na 120 m2 nasada bobica ili 1,5-2 kg po hranilištu jednog stabla (ovisno o shemi sadnje).

Navedene metode inokulacije biljaka vrlo su raznolike, s određenim promjenama koje su primjenjive za rad s gotovo svim fitopatogenim gljivama na velikom broju poljoprivrednih biljaka..