Dijagnostičke metode za virusne i virusne bolesti biljaka

Vizualna dijagnostička metoda

U većini slučajeva nije teško utvrditi virusnu prirodu bolesti. Obično ga određuju vanjski znakovi, poput linearnih klorotičkih uzoraka ili prstenastih uzoraka na mladim lišćima. Međutim, njihova je identifikacija često teška jer virusi imaju asimptomatski (latentni) karakter razvoja. Simptomi ovise o stanju organizma, agresivnosti soja patogena, okolišnim uvjetima i duljini vremena boravka virusa ili virusa u stanicama domaćina. Na primjer, simptomi bolesti su jasno izraženi u biljkama koje rastu na jakom svjetlu i na umjerenoj temperaturi, pri visokoj temperaturi i pri slabom osvjetljenju, simptomi bolesti se uopće ne mogu izraziti..

Razjašnjenje vena najmlađih listova često je jedan od prvih znakova sistemske virusne infekcije. Vene postaju žute i prozirne. Kasnije lišće koje može biti mozaik, pjegavo ili potpuno žuto (klorotično)..

Razdoblje inkubacije bolesti ovisi o vrsti virusa, biljci domaćina i uvjetima okoliša, ali u svakom slučaju je nekoliko dana ili tjedana.

Ako su prvi simptomi viroze uočljivi na sadnicama, tada je izvor zaraze bilo u sjemenu ili se zaraza dogodila putem nosača. Ako su zaražene biljke smještene u kulturi potpuno slučajno ili samo u redovima posađenim iz iste serije, onda to ukazuje da je sadni materijal najvjerojatnije zaražen. Ako se bolesne biljke nađu na određenim područjima polja, a pojava zaraženih područja je zbog razlika u tlu, postoji svaki razlog da pretpostavimo širenje virusa kroz tlo.

Također treba napomenuti da postoje simptomi karakteristični za virozu, ali uzrokovani drugim uzrocima (lezije fitoplazme, neke bakterije i sisa štetočine). Simptomi slični virusnoj infekciji često su uzrokovani poremećajima mineralne prehrane, poput onih povezanih sa nedostatkom željeza (Sl. 1). Različite deformacije organa mogu biti uzrokovane regulatorima rasta i herbicidima raznih vrsta (Sl. 2).

Prema tome, primjenom metode vizualne dijagnostike, točna identifikacija vanjskim znakovima oštećenja virusima i viroidima nije moguća, jasan odgovor može se dobiti samo instrumentalnim metodama (enzimski imunosorbentni test, PCR analiza itd.).

Metoda biljaka indikatora

Metoda biljaka indikatora - Vrlo je uobičajena metoda dijagnosticiranja virusnih i virusnih bolesti i identifikacija njihovih patogena. Metoda biljnih indikatora temelji se na uporabi biljaka indikatora, koje u većini slučajeva daju jasne i specifične simptome karakteristične za određenu vrstu patogena. Biljke indikatorske biljke zaražene su mehaničkim cijepljenjem sokom, što rezultira infekcijom kao lokalna nekroza, promjene boje i inhibicija rasta.

Za virus paradajz aspermije koristi se mlado bilje za duhan kao pokazatelj (Nicotiana glutinosa), za dijagnozu krumpira X-virusa - sferni amarant (Gomphrena globosa). Za otkrivanje infekcije rajčice virusima, vretenasti gomolji gomolja krumpira koriste skopoliju kao pokazatelje (Scopolia sinensis) ili osjetljive sorte rajčice. U nekim slučajevima se za infekciju mogu koristiti pojedinačni izolirani listovi biljaka indikatora. Virusi otporni na sokove cijepljeni su na biljke indikatore raznim metodama. U rijetkim slučajevima za prijenos virusa koriste se insekti i biljka parazita.

Serološki dijagnostička metoda

Metoda se temelji na reakciji taloženja (stvaranje taloga) između specifičnih antitijela i proteina (antigena) patogena. Metoda serološke dijagnoze nije primjenjiva za identifikaciju viroida zbog nepostojanja proteinske komponente, kao ni za niz virusa intolerantnih na sokove slabih imunogenih svojstava. Sljedeće modifikacije serološke dijagnostike mogu se koristiti za identifikaciju virusa u biljci:

1) Enzimski imunosorbentni test (ELISA) - najosjetljivija metoda koja vam omogućuje dobivanje kvantitativnih procjena. Temelji se na specifičnom prepoznavanju površinskih antigena virusa antitijelima u prisutnosti enzima. Ova metoda se široko koristi u praksi za identifikaciju virusa usjeva, pogodnih za serijske analize.

2) Metoda kapanja. Provodi se na sljedeći način. Na staklenom toboganu pomiješa se kap biljnog soka s kapljicom antiseruma. Nakon par minuta, reakcija se procjenjuje pod mikroskopom pri malom uvećanju u tamnom polju ili čak vizualno, bez mikroskopa.

3) Metoda dvostruke difuzije - provodi se u agar gelu kako bi se odredili sferni i drugi mali virusi. Provodi se ovom metodom, u neke jažice, koje su izrezane u sloj agarnog medija, dodaje se antiserum, a u druge - pročišćeni biljni sok. U gelu se virusne čestice i antitijela difuzuju jedna na drugu, a na mjestu susreta formiraju različite taložne linije u slučaju njihove komplementarne specifičnosti.

4) Metoda radijalne imunodifuzije. Pomoću ove metode, antiserum se dodaje izravno u agarni medij, a jažice se pune biljnim sokom. Reakcija je pozitivna ako se oko jažica formiraju talog u obliku prstena..

5) Metoda adsorpcije. Metoda se temelji na činjenici da prije reakcije s antigenom, antitijela vežu neki inertni materijal na velike čestice, na primjer, lateks. Kada reagira s antigenom, dolazi do jasno vidljive aglutinacije cijelog kompleksa..

Metoda elektronske mikroskopije

Na ultra tankim dijelovima obolelih biljnih tkiva, pomoću elektronskih mikroskopa, možete odrediti strukturu, oblik, pa čak i veličinu virusa ili viroida. Često se koristi elektronski mikroskop u kombinaciji sa serološkim metodama (imunoelektronska mikroskopija), a virusne čestice s slojevitim antitijelima mogu se detektirati. Metoda elektronske mikroskopije koristi se izuzetno rijetko zbog visokih troškova opreme i reagensa, poteškoće u izolaciji virusa i viroida, oksidacije biljnih presjeka i niza drugih faktora.

Metoda elektroforeze

Ova metoda temelji se na odvajanju prethodno pročišćenih nukleinskih kiselina virusa (viroid) ili njegovih proteina u gelu pod utjecajem električne struje, nakon čega slijedi bojenje zona. Metoda elektroforeze omogućuje vam određivanje mase i veličine virusnih ili virusnih struktura. Metoda se široko koristi za vizualni pregled konačnog proizvoda lančane reakcije polimeraze. Da biste zabilježili rezultate, fotografirajte gel u preljevanoj ili refleksnoj svjetlosti.

Molekularno biološke metode temelje se na poznavanju strukture molekule RNA (DNA) virusa ili virusa. Najčešći test je amplifikacija (umnožavanje) nizova specifičnih za RNA sekvence tijekom lančane reakcije polimeraze (PCR). Pojedinačni fragmenti RNA izolirani iz ispitivanih biljaka koji su specifični za samo jednu vrstu ili rod virusa množe se enzimima u prisustvu prajmera (odgovarajući oligonukleotidi). Nadalje, njihov broj u konačnom proizvodu reakcija milionima prelazi početni broj kopija odabranog RNA fragmenta. Zatim se virusna RNA (DNA) detektira gel elektroforezom ili imunofluorescencijom. Metoda se široko koristi u praktičnim virološkim studijama..

Metoda DNK sonde također se temelji na principu komplementarnosti nukleinskih kiselina. Sintetiziraju se specifične sonde koje hibridiziraju samo sa specifičnim nukleotidnim nizovima virusa ili virusne RNA. Ovisno o izboru sondi, moguće je razlikovati skupine, vrste, pa čak i sojeve virusa i viroida.

Metoda inkluzije

Nakon razvoja virusa, nakupine virusnih čestica (inkluzije) nazvane Ivanovsky kristali, koji su vidljivi pomoću konvencionalnog svjetlosnog mikroskopa, formiraju se u biljnim stanicama. Svaki virus ima svoj oblik virusnih inkluzija, koji se formiraju, najčešće, u stanicama epiderme lišća ili u stanicama vlasi. Na primjer, virus duhanskog mozaika ima kristale u obliku šesterokutne i igle - krumpir X virus obično oblikuje sferna amorfna tijela. Za otkrivanje virusa krastavca, listova krumpira i nekih drugih zelenog pjegastog mozaika koriste se kemijske analitičke dijagnostičke metode..