Izolacija fitopatogenih gljiva u čiste kulture

Kao što je istaknula N. A. Naumov (1937.), skup metoda izoliranja i uzgoja gljivica varira u širokom rasponu, ovisno o svrsi studije. Međutim, koncept eksperimenata uklapa se u jedan sustav. Prije dobivanja proučavane gljivice u čistoj kulturi, potrebno je imati spore noseće tkivo ili micelij, bez infekcije epifitnom mikroflorom, koja ponekad iskrivljuje sliku, što otežava identifikaciju i izolaciju pogođenih tkiva..

Jedna od najjednostavnijih metoda dobivanja micelija ili sporaulacijskih organa (uključujući brojne obligacijske parazite) je uporaba tzv. mokre komore. Obično se koristi za njihovu izradu. petrijeve posude ili Koch je. Dno čaše i unutarnja površina kapaka obloženi su krugovima filtrirajućeg papira odgovarajućeg promjera, sterilizirana dva sata na temperaturi od 110 ° C i navlažena sterilnom vodom. Mali dijelovi ispitivanih tkiva u količini od 3-10 uzoraka nakon površinske sterilizacije iznose se na dno čašica izravno na filter papir ravnomjerno po njegovoj površini..

Površinska sterilizacija dijelova oboljelog tkiva može se provesti pomoću plamena alkoholnog plamenika (plamen), struje vode ili posebnih kemikalija. Metoda površinske sterilizacije prirodnog supstrata pogodna je za drvo, korijenje, sjeme ili plodove. Što je predmet s većim volumenom steriliziran, to je temeljnije i duže moguće zagrijavanje, bez straha za održivost micelija unutar tkiva.

Ponekad je potrebno izolirati patogenu gljivicu iz polu-raspadanog materijala ili blatnih dijelova biljke (periterapija krasta na opalom lišću itd.). U tom se slučaju testni predmet stavlja na sitno sito i ispire nekoliko sati pod tekućom vodom.

Nakon toga, materijal uzet za istraživanje dodatno se čisti i dezinficira s površine potapanjem u jednu od sljedećih tvari: 96- ili 50. alkohola u trajanju od 2-3 minute - otopina živog klorida (0,1) s izlaganjem od nekoliko sekundi do tri minute - 0,5-1,0-tna otopina kalijevog permanganata (do 20 min) - pročišćena otopina izbjeljivača (prva) - 0,1-1,0-tna otopina bromove vode (nekoliko sekundi) ili u otopine drugih dezinfekcijskih sredstava nakon čega slijedi pranje u sterilnoj vodi. U tu svrhu se može koristiti otopina formalina 1: 300, a zatim isparavanje predmeta u posudi s njegovom parom od 30 minuta do 2 sata.

Studije gljivica koje se razvijaju u vlažnim komorama potrebno je provoditi izravno u čašama pri malom uvećanju mikroskopa u propuštenom ili reflektiranom svjetlu..

Nakon pojave sporulacije ili znakova razvoja micelija, subkultivira se na agarnom hranljivom mediju izravno u epruvetu za kosi agar ili prethodno na agarni mediju prolivenu u Petrijeve posude. Obavezni paraziti uzgajaju se na živim biljkama ili u posebnim okruženjima.

Za daljnji rad vrlo je važno pročišćavanje kulture. To se postiže ožičenjem šipki, razrjeđivanjem u sterilnoj vodi ili pomoću epruveta.

1. Mala količina gljivice odnese se u petlju za kulturu i utisne na površinu agara u Petrijevim posudama. Kako se moždani udar produžava, spore se sve više i više dijele dok, kao rezultat toga, pojedine kolonije ne nastaju iz nekoliko ili pojedinačnih spora.

2. Spore inokuluma stavljaju se u epruvetu sa sterilnom vodom (10 ml), zatim se određena količina suspenzije (na primjer, 1 ml) sterilnom pipetom prenosi u epruvetu s 9 ml sterilne vode. Svježa sterilna pipeta koristi se za miješanje tekućine i prijenos 1 ml u sljedeću epruvetu s 9 ml sterilne vode. Uzgoj se nastavlja prema potrebi. Takvo deset tisućito razrjeđenje ima neke prednosti u odnosu na oštro ožičenje. U konačnom razrjeđivanju, otopljenom agaru se dodaje 1 ml suspenzije spora, ohlađeno na oko + 40 ° C..

3. Uzmite pet epruveta odgovarajućeg agarskog medija, otopite ih i ohladite na + 45 ° C. Potom se u jednu od epruveta unese mala količina spora - epruveta se pomiče između dlanova ruke, a sadržaj se izlije u Petrijevu posudu. Prazna epruveta ponovo se napuni iz druge epruvete otopljenim medijem, pomiče se između ruku i izlije u drugu čašu. Ovaj postupak se ponavlja s ostale tri epruvete..

Tijekom provođenja teorijskih istraživanja ili analize stanovništva bilo kojeg zemljopisnog oblika, postaje potrebno dobiti kulturu iz jednog spora. Gotovo monosporna kultura mnogih gljiva dobiva se na sljedeće načine.

1. Slaba suspenzija spora priprema se na sterilnom staklenom toboganu u sterilnoj vodi uranjanjem kalcinirane navlažene petlje u sporulacijsku kulturu. Ova suspenzija spore prošarana je duž crte u Petrijevoj posudi na vrlo tankoj ploči s agarima pripremljenom u prokuhanoj vodi i čuvana na + 24 ° C. Ako se to učini u 16-17 sati, tada se sljedećeg dana u 9-10 sati obično uoči početak klijanja i spremnost spore za izolaciju..

Kada radite s dvogledom (stereoskopski mikroskop), Petrijeva posuda pomiče se duž crte marke i odabire se prikladni klice. Odgovarajuća igla izrađuje hangar od oko 2 mm oko spore. Taj se kvadrat i područje neposredno oko njega provjeravaju pod malim povećanjem biološkog mikroskopa kako bi se osiguralo da postoji samo jedna spora.

Blok vrapčastog agara se zatim prenosi sterilnom iglom ispod dvoglepa u ploči ili epruveti sa agarima.

2. Hranjivi medij se u tankom sloju izlije u sterilnu Petrijevu posudu, zatim se uzme epruveta sa sterilnom vodom i u nju se unese mala količina spora testne gljive i temeljito se protrese u vodi. Nakon toga, 4-5 kapi suspenzije spora uzima se metalnom petljom i prebaci se na stakleni tobogan. Pod mikroskopom broji se broj spora u svakoj kapi. Ako se pad prosječno zaključi n spora, sterilna voda se dodaje u epruvetu kako bi se povećao njen volumen u n+1 put.

Štoviše, možemo pretpostaviti da će u jednom padu biti prosječno jedan spor. Nakon toga, 3-4 kapi se uzmu iz epruvete sa razrijeđenom suspenzijom spora i prenesu u Petrijeve posude na agarskom mediju. Kapi trebaju biti odvojene jedna od druge na relativno velikoj udaljenosti. Pod mikroskopom provjerite broj spora koje padaju u svaku od ovih kapi. Gledanje je s dna šalice, koji je za to pažljivo okrenut. Istodobno, one se biraju među kapljicama u kojima se nalazi jedna spora i na čaši su označene voštanom olovkom. Kolonije dobivene u Petrijevim posudama pregledavaju se u nagibnim epruvetama od agara.

Ponekad se kap kapljica suspenzije koja sadrži jednu sporu stavi na sterilnu čašu u Petrijevoj posudi i dodaje se komadić agar medija - nakon što se micelij gljike obraste s njom, kultura se prenese u epruvetu ili Petrijevu posudu.

3. Hansen (H. R. Hansen, 1926.) koristio je tanke staklene kapilare, spuštene suspenzijom spora u topao agar. Te kapilare su zatim mikroskopski ispitane i izrezane na komade, od kojih je svaki sadržavao po jednu sporu. Takvi komadi su zatim podvrgnuti površinskoj sterilizaciji i stavljeni u agar ploču.

Možete koristiti i druge metode dobivanja kultura monospora, koje su navedene u literaturi (na primjer, metoda "suhe igle" Hannah i drugih). Dakle, da bi se iz uredospora dobila monofos kultura, hrđe žitarica se otresu na suhom staklenom stakalcu. Zatim se kraj izvučene staklene šipke odvaja jedna spora ispod dalekozora ili s malim uvećanjem mikroskopa. Kraj štapa prethodno se obriše pamučnom vunom navlaženom metiliranim duhom ili alkoholom. Odabrana spora prenosi se u kapljici vode na list biljke. Takve se manipulacije provode oko 200 puta, imajući u vidu da je stopa preživljavanja obično 6-10.

Kada se izolira monopoduljska kultura gljive, provodi se preliminarno razmnožavanje populacije hrđe, tako da se na lišću formiraju pojedinačni uredopustuli. Za to se koristi mala količina spore za inokulaciju..

Nakon primanja početnih pustula kao rezultat monospore ili monopuskularne kulture gljive, počinju množiti spore u njima na određenim sortama, ponavljajući proces reprodukcije biljaka dobro razvijenim uretropodima 2-3 puta. Kao rezultat toga, nakuplja se dovoljna količina inokuluma za daljnji rad s njim.

Izolacija čistih kultura iz različitih organa i tkiva ima svoje osobine. S površinskim oštećenjem ploda, vanjski oštećeni sloj se odstranjuje i micelij klija u vlažnoj komori, nakon čega slijedi resesed kolonije na agarskom mediju. Prethodno zahvaćena površina temeljito se ispere sterilnom vodom..

Kada se izoliraju kulture iz unutarnjih dijelova fetusa, tijekom 5 minuta temeljno se isperu, dezinficiraju živinim kloridom (1: 100), a zatim se ponovno ispere u sterilnoj vodi, plodni komadi izrezani iz unutarnjih tkiva sterilnim skalpelom postave se na hranjivi agar.

Kada izolirate patogene koji uzrokuju vanjsko oštećenje korijena, koristite tehniku ​​opisanu za plod. S unutarnjim lezijama korijenje se temeljito ispere, zapalji, a zatim se izrađuju poprečni ili uzdužni presjeci. Rezultirajući mali komadi unutarnjeg bolesnog tkiva klijaju na mediju za agar kulturu..

Izolacija gljivica iz lišća, latica i drugih osjetljivih organa povezana je s poznatim poteškoćama, jer se u ovom slučaju gotovo mora odustati od površinske sterilizacije uz pomoć kemikalija koje mogu utjecati na micelij patogena u mesofilu. Da biste povećali točnost i pouzdanost selekcijskog rada, trebali biste koristiti što je moguće manje dijelove tkiva, istodobno povećavajući njihov ukupni broj.

Gljive koje inficiraju koru i drvo (traheomikoza, trulež, nekroza) mogu se izolirati izravno iz pogođenog tkiva stavljanjem površinski steriliziranih komada ili kriški na kulturni medij ili od spora i micelija dobivenih u vlažnoj komori. Drvo i kora trebaju biti svježi jer se gljivice plijesni razvijaju u ustajalim uzorcima koji začepljuju usjev..

Pogođeno drvo se dezinficira nekoliko minuta uranjanjem u 95% -tnom alkoholu ili 0,5% -tnoj otopini kalijevog permanganata, nakon čega slijedi plamen. Zatim se površinski dijelovi uzorka odrežu sterilnim skalpelom ili mikrotomom, a ploče debljine od nekoliko mikrona do 5-10 mm izrezuju iznutra i prebacuju u hranjivi medij.

Kada se kultura izolira iz voćnih tijela himenomiketa, prvo se reže površinski sloj, a sitni komadi, promjera 4-5 mm, izrezuju se s unutarnje strane voćnog nosača i pola se uroni u hranjivi agar. Zatim se razvijeni micelij prenosi u obodni agar.

Da bi se izolirao endogeni micelij iz mladih sadnica, pogođeni dijelovi se ne steriliziraju, već se samo peru kako se ne bi ubili - materijal se lagano probavlja i stavlja na hranjivi agar ili u vlažnu komoru - micelij koji se pojavljuje brzo se odvaja, pokušavajući spriječiti rast saprofitnih mikroorganizama.

Starije sadnice se dezinficiraju u 0,5% otopini kalijevog permanganata, isperu vodom i stave u vlažnu komoru odakle se razvijeni micelij prenosi u hranjivi medij. Također je moguće koristiti dijelove stabljike, položene na agar, da klijaju micelij patogenih gljivica..

Mikroflora oboljelog sjemena obično se analizira nakon njegovog razvoja u kulturi na hranjivom mediju (M M. Samutsevich, 1931). Da bi se to postiglo, uzima se ukupni uzorak iz šarže sjemena sa raznih mjesta, broji se 200 sjemenki i 25 komada se stavi u Petrijeve posude na agarskom mediju.

Pri određivanju površinske infekcije, sjeme se ne sterilizira; radi uspostavljanja duboke infekcije čuva se u kalijevom permanganatu (0,5) 2-3 minute ili se potapa u čisti alkohol 1 minutu.

U nekim se slučajevima očišćene sjemenke sijeku sterilnim skalpelom na dva dijela. Jako mumificirane sjemenke se inkubiraju na filtriranom papiru navlaženom sterilnom vodom, a nakon sušenja i plamenjačenja stavljaju se u Petrijeve posude. Kako se pojavi sporalacija patogena, oni se prenose u obodni agar.

Kada je izolirana čista kultura, gljive se preliminarno uzgajaju na blago zakiseljenom agarskom mediju ili želatini (N. A. Naumov, 1937). Tijekom početne izolacije patogena, ne može se koristiti tekući ili jako navlažen medij jer to doprinosi razvoju saprofitnih mikroba. Također ne smijete sijati patogene gljive na čvrsti hranjivi medij: rižu, krumpir, kruh i druge proizvode.

Da bi se identificirali patogeni koji u zemlji postoje, u svrhu naknadne izolacije uzimaju se uzorci karakterističnih razlika tla (podzol, černozem, serozem itd.) Na različitim dubinama određenih kultura itd. Prilikom uzorkovanja odsječak tla tada je sterilan alat odvaja željeni sloj, iz kojeg se uzima uzorak od 10-20 g, stavljajući ga u sterilnu posudu ili omotnicu. Preporučuje se uzimanje tla s gornjeg stajanja (do 3 cm) i dublje, na razini mjesta glavne mase korijena. Za potpuno karakteriziranje mjesta potrebno je u tri godine pribaviti podatke o prethodnim kulturama i kiselosti tla (pH).

Kod proučavanja raspodjele infekcije u polju iskopavaju se jame tla na svakih 5 m na jednakom području; za izviđačke preglede dovoljno je 5-10 jama tla po odjeljku.

Sakupljeno tlo se nekoliko dana suši na zraku suhom stanju u papirnatim omotnicama, drobi i postavlja na hranjivu podlogu agar pomoću sterilne lopatice, skalpela i drugog alata. Svaki uzorak (10–20 g) raspoređuje se u 6–7 Petrijevih posuda, a potom se čuva u termostatu na temperaturi 20–25 ° C i periodično se pregledava. Kako se razvijaju gljivične kolonije, u epruvetama se prenose u kosi agar. Prisutnost izoliranih gljivica određuje se konvencionalnim metodama. Nakon 7-8 dana od početka rasta kolonija, šalice postaju neprikladne za pretragu gljivica zbog onečišćenja okoliša saprofitnim mikroorganizmima.

Proučavanje gljika-mikromiceta iz tla moguće je izoliranjem u čistu kulturu ili primjenom metode "obraštanja ploča", mikrokamerama tla, pedoskopom od vrlo tankog stakla i drugim tehnikama.

Izolacija mikroorganizama, uključujući fitopatogene gljive, u održivom stanju od vode i zraka, područje je posebnog istraživanja. Postoje različite metode analize koristeći uzorke, automatske volumetrijske i inercijalne spore (F. Gregory, 1964. - Yu. P. Bochkov, A. I. Voronova, V. F. Dumsky, 1966. - A. I. Klochko, 1969, itd.) )..